腺病毒介导hSulf-1表达对肿瘤细胞周期及化疗敏感性影响的实验研究

【摘要】人硫酸酯酶1（humansulfatase1,hSulf-1）基因定位于人8号染色体长臂8q13.39，编码一种芳香硫酸酯酶，在某些肿瘤细胞系可明显抑制肿瘤生长迁移及增强一些抗癌药物诱导的凋亡作用，因此被认为是肿瘤抑制因子。硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPGs）是细胞外基质的重要组成部分，能够直接介导肝素结合的细胞生长因子配体和特异受体（HB-GFR）之间的相互作用。hSulf-1能够使HSPGs脱硫酸化，抑制HSPGs介导的信号通路的活性，进而抑制细胞的增殖、侵袭、迁移、血管增生及转移灶的形成。除此之外，它还与细胞的粘附性、细胞骨架修复、凝血功能、以及转化生长因子β（TGF-β1）、Wnt/β-catenin、AKT/ERK和细胞上皮间质转化的信号通路的活性高度相关。本研究旨在构建含有目的基因hSulf-1的多种类型腺病毒表达载体（包括非增殖型腺病毒Ad5-hSulf1、溶瘤腺病毒AdSurp-hSulf1和放射诱导增强型溶瘤腺病毒Ad.eSurp-hSulf1），研究hSulf-1对肝癌细胞周期以及对乳腺癌化疗敏感性的影响，探讨hSulf-1抗肿瘤效应及其分子机制。我们的研究为将来进行肿瘤靶向治疗奠定了基础。第一部分腺病毒载体构建及鉴定
【作者】徐高亚；
【导师】苏长青；
【作者基本信息】苏州大学，病原生物学，2014，硕士
【目的】克隆hSulf-1基因并构建稳定表达的非增殖型腺病毒载体Ad5-hSulf1、肿瘤特异增殖型溶瘤腺病毒载体AdSurp-hSulf1、放射诱导增强型溶瘤腺病毒载体Ad.eSurp-hSulf1及其相应的携带绿色荧光报告基因（EGFP）的阴性对照病毒Ad5-EGFP、AdSurp-EGFP、Ad.eSurp-EGFP。
【方法】以质粒pcDNA3.1-hSulf1为模板，设计含有BamHI和SalI酶切位点的hSulf-1基因上下游引物，采用PCR的方法扩增出含有hSulf-1基因的完整序列，将pDC315及hSulf-1基因酶切回收的产物连接，得到pDC315-hSulf1；以hSulf-1基因酶切回收产物置换pAdSurp-P53中的P53序列，获得pAdSurp-hSulf1；在pAdSurp-hSulf1启动子Surp上游插入Egr-l基因CArG调控元件作为增强子构建pAd.eSurp-hSulf1。以EGFP基因置换pDC315-hSulf1、pAdSurp-hSulf1、pAd.eSurp-hSulf1中的hSulf1，构建pDC315-EGFP、pAdSurp-EGFP、pAd.eSurp-EGFP。鉴定正确后，用Lipofectamine2000转染试剂，将pDC315-hSulf1、pAdSurp-hSulf1、pAd.eSurp-hSulf1分别与腺病毒包装质粒pBHGloxdelEl3cre共转染HEK293细胞中，包装产生非增殖型腺病毒载体Ad5-hSulf1、溶瘤腺病毒AdSurp-hSulf1、放射诱导增强型溶瘤腺病毒Ad.eSurp-hSulf1。同样方法获得表达EGFP的阴性对照病毒。
【结果】成功构建了非增殖型腺病毒载体Ad5-hSulf1、溶瘤腺病毒载体AdSurp-hSulf1、放射诱导增强型溶瘤腺病毒载体Ad.eSurp-hSulf1及其对应的阴性对照病毒，并且能够在真核细胞中表达目的基因。
【结论】表达hSulf-1的腺病毒载体构建成功，为下一步研究基因的功能、探讨目的基因对肿瘤细胞周期以及对化疗药物敏感性的影响奠定了基础。第二部分腺病毒介导hSulf-1表达对肿瘤细胞周期的影响
【目的】研究腺病毒介导的hSulf-1基因感染肝癌和乳腺癌细胞系后，细胞周期分布的变化。
【方法】采用蛋白质免疫印迹法检测hSulf-1基因在肝癌细胞系和乳腺癌细胞系中的表达情况，用流式细胞术检测肿瘤细胞过表达hSulf-1基因后细胞周期分布变化。
【结果】蛋白质免疫印迹检测hSulf-1在肝癌细胞系SMMC-7721、MHCC-97L及乳腺癌细胞系MCF-7中低表达，流式细胞术检测结果显示：hSulf-1低表达肿瘤细胞感染Ad5-hSulf1后细胞周期出现G2/M期阻滞。
【结论】hSulf-1基因的过表达可引起肿瘤细胞周期分布变化。第三部分腺病毒介导hSulf-1表达拮抗bFGF引起的肝癌细胞周期变化及抗肿瘤效应
【目的】研究hSulf-1拮抗bFGF引起的肝癌细胞周期变化及其抗肿瘤效应。
【方法】以bFGF诱导刺激肝癌细胞SMMC-7721和肝正常细胞WRL-68，然后感染Ad5-hSulf1；流式细胞术检测细胞周期变化，蛋白免疫印迹检测细胞周期相关蛋白CDK4、E2F的变化，MTT、Transwell、划痕实验分别检测细胞增殖、侵袭和迁移能力变化。
【结果】流式细胞术实验结果表明，hSulf-1基因能够拮抗bFGF刺激引起的细胞周期演进，诱导细胞周期阻滞。蛋白免疫印迹实验结果表明bFGF刺激后的SMMC-7721细胞周期相关蛋白CDK4、E2F上调，而hSulf-1可明显拮抗bFGF的作用，下调这两种蛋白的表达。MTT实验结果表明，hSulf-1基因可拮抗bFGF引起的细胞增殖。Transwell和划痕实验结果表明，hSulf-1可拮抗bFGF的作用，抑制SMMC-7721细胞的侵袭和转移。
【结论】hSulf-1拮抗bFGF刺激引起的肝癌细胞周期变化并且能抑制细胞的增殖、侵袭和迁移能力。第四部分腺病毒介导hSulf-1表达提高乳腺癌细胞MCF-7对AZD2281敏感性的研究
【目的】探讨人硫酸酯酶-1（humansulfatase1，hSulf-1）基因重组腺病毒Ad5-hSulf1对乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移及其化疗敏感性的影响。
【方法】将重组腺病毒Ad5-hSulf1感染MCF-7细胞，采用不同浓度AZD2281处理细胞，并筛选AZD2281处理的最佳浓度用于后续实验，采用流式细胞术检测细胞周期，用软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成率，蛋白免疫印迹检测细胞周期蛋白CDK4及p-AKT的表达，Transwell法、MTT法分别检测细胞迁移及增殖能力。
【结果】AZD2281浓度为7μmol/L时对MCF-7细胞的抑制作用趋于峰值，用于后续实验。Ad5-hSulf1+AZD2281组与AZD2281组相比，G2/M期细胞比例明显增多，细胞克隆形成率及细胞周期蛋白CDK4的表达、AKT的磷酸化水平均明显下调，同时细胞增殖率、迁移率也有明显下降。
【结论】hSulf-1过表达可明显提高乳腺癌细胞MCF-7对AZD2281的敏感性，阻滞细胞周期于G2/M期，并抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移能力，从而为乳腺癌的药物治疗提供新的临床参考依据。
【关键词】腺病毒；Ad5-hSulf1；细胞周期；bFGF；AZD2281；细胞侵袭；周期蛋白；

【参考文献】
[1]李烨.新时期汉俄外来词及其翻译技巧对比[D].西安外国语大学,俄语语言文学,2013,硕士.
[2]朱玉琳,杨庆远.冷旋压封头力学性能的试验研究[J].石油化工设备.1991(06)
[3]周萌.信息技术对政府决策影响研究[D].燕山大学,行政管理,2013,硕士.
[4]李瑾璐.模糊数学在自杀研究中的应用[D].中南民族大学,社会学,2013,硕士.
[5]刘霜,张建霞,刘希东.氧化石墨烯增强鲁米诺-过氧化氢化学发光测定姜黄素[J].重庆文理学院学报(社会科学版),2014,05:99-103.
[6]王普,任峰,黄金,何军邀.含离子液体介质中生物拆分制备S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸[J].浙江工业大学学报,2013,04:409-413+435.
[7]戚娟.论人为添附新增土地的环境法律规制[D].山东师范大学,环境与资源保护法学,2013,硕士.
[8]王单.低密度校验码理论及其译码研究[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2004,硕士.
[9]方春芳.桃胶基碳材料的制备及其应用研究[D].华中农业大学,应用化学,2014,硕士.
[10]张俊峰.汽车主动悬架控制策略研究及分析[D].兰州理工大学,机械工程,2013,硕士.
[11]刘杰.二手工程机械评估方法研究[D].长安大学,机械工程（专业学位）,2013,硕士.
[12]姚雨佳,杨剑青,张晓英.大学生内隐老化刻板印象的情境效应[J].杭州师范大学学报(自然科学版),2014,06:.
[13]麻靖宇.榆林市农村金融发展研究[D].西北农林科技大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[14]刘晓鸥.泰国成教委汉语教学实践报告[D].吉林大学,汉语国际教育,2014,硕士.
[15]李辉.以英语为母语留学生离合词习得偏误分析[D].湖南师范大学,对外汉语,2014,硕士.
[16]宋鹏.蛇床子素的抗骨质疏松作用及其分子机制研究[D].兰州理工大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[17]郭颂,杜晓刚,刘晓云,刘慧慧,王华,郝玉英,许并社,赵建国,郭鹍鹏.氧化石墨烯作为共蒸镀掺杂材料在OLED中的应用[J].发光学报,2013,05:595-599.
[18]马健.强双光子吸收吡啶类配合物的合成、结构及性质研究[D].安徽大学,无机化学,2004,硕士.
[19]魏芳芳.东北地区气候时空变异特征研究[D].东北师范大学,自然地理学,2012,硕士.
[20]张华明.可持续发展与中国铁路运输[J].中国铁路.2003(07)
[21]刘彦汝.基于二阶Taylor展式的模糊TS神经网络辨识[D].大连理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[22]蒋慎言,马竹梧.鞍钢三炼钢ANS-OB钢水处理装置三电自动化系统[J].冶金自动化,2002,05:56-58.
[23]宋新辉.一次冷涡暴雨过程分析[D].南京气象学院,气象学,2003,硕士.
[24]郑炜,倪明放.一种基于粗糙集的决策规则算法[J].军事通信技术,2002,04:49-52.
[25]程文韶.一种基于BCH码的NAND Flash控制器的研究与设计[D].华中科技大学,集成电路工程,2013,硕士.
[26]林建成,安娜.国家治理体系现代化视域下构建生态治理长效机制探析[J].理论学刊,2015,03:85-92.
[27]李梦丽.大型矿用带式输送机盘式制动器热—结构耦合分析[D].郑州大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[28]孙蕾.基于分子印迹聚合物材料的新疆地产精油特征成分的分离和富集[D].新疆大学,化学,2013,硕士.
[29]谢蓉.基于分子印迹技术的莠去津竞争性金标试纸条研制[D].浙江大学,植物保护,2012,硕士.
[30]彭修泉,刘志勇,宋映明.数据安全与数据库加密——“数据库加密应用群件系统”课题介绍[J].华南金融电脑.2002(03)
[31]范圣韬,李夏青,李运华.改进约束的传输线频率相关转换矩阵平滑算法[J].电力系统自动化,2008,11:25-29.
[32]龙文兴,丁易,臧润国,杨民,陈少伟.海南岛霸王岭热带云雾林雨季的环境特征[J].植物生态学报,2011,02:137-146.
[33]闫晓慧.基于生物分子网络的中药木贼药效物质基础研究[D].佳木斯大学,药物分析学,2014,硕士.
[34]李林.山东苔类植物研究[D].山东师范大学,生态学,2013,硕士.
[35]铁萍.MSCT下肢动脉血管成像扫描方案优化及血管质量观察[D].兰州大学,医学影像与核医学,2013,硕士.
[36]陈菲.民营企业档案管理模式研究[D].广西民族大学,档案学,2013,硕士.
[37]谭黎.煤矿企业逆向物流的演化博弈分析及激励机制研究[D].郑州大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[38]杨永海.新型冲击式液压桩锤系统设计及仿真研究[D].吉林大学,2008.
[39]张雨诗.缺陷产品召回民事法律问题研究[D].辽宁大学,法律,2012,硕士.
[40]朱小爱.热噪声环境中双模纠缠光场的纠缠演化[D].华中师范大学,光学,2013,硕士.
[41]安博.软骨细胞与静电纺丝PCL支架灌流培养构建组织工程软骨的实验研究[D].河北医科大学,外科学,2013,硕士.
[42]陆健.南京市常用建筑材料放射性分析与评价[D].南京师范大学,环境科学,2012,硕士.
[43]陆玲.三维腹腔镜图像传感检测与图形用户界面显示系统设计[D].浙江大学,生物医学工程,2014,硕士.
[44]高博书.中文歌舞在对外汉语教学中的应用研究[D].吉林大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[45]李翠霞.数据挖掘技术在GIS中的应用初探[J].科技创业月刊,2004,12:114-115.
[46]邹俊.成山头附近海域船舶雾航安全监管对策研究[D].大连海事大学,交通运输工程,2014,硕士.
[47]樊文通.仪器仪表材料的现状与展望[J].仪表材料.1986(05)
[48]龙红,雷超,陈超.基于VisualFoxPro实现数据仓库技术[J].四川轻化工学院学报,2002,03:29-32.
[49]程宗明.依靠科技进步,搞好节电发电工作[J].油田地面工程.1990(03)
[50]魏燕芳.胺基化磁性壳聚糖微球固定Ct处理含酚废水研究[D].福建师范大学,高分子化学与物理,2004,硕士.